如何快速构建属于自己的基因敲除细胞系？这是很多做细胞基因功能研究的人关心的问题，需要多久？具体的流程? 怎么选择细胞？如果这些问题也困扰着你，那我们一起来看看如何快速构建一个基因敲除细胞系吧。
基础背景：Cas9技术（这个有视频，可以自己学习一下；如何设计gRNA，如何选择位点，视频里面都有，链接如下： ，看完这些视频就是Cas9技术的行家啦）
下面开始介绍一下如果构建基因敲除细胞系：
第一步、如何选择细胞选择细胞：A549（人肺癌细胞，做肺部细胞功能研究），Huh7、HepG2（人肝癌细胞，做肝脏研究），HEK293（做蛋白表达和基因功能研究），HCT116（人结肠癌细胞，上皮样细胞），K562（人白血病细胞，血液细胞），CAL27（人口腔鳞癌细胞，口腔研究），THP-1（人单核巨噬细胞），RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞）.........[需要研究可以关注公众号咨询]
选好细胞最为重要：
1、上面的细胞就是比较好做的啦，好的细胞增殖好，培养基简单（有些细胞加的因子，会让你怀疑经费够不够被细胞宝宝吃的），最重要的是是不是能够形成单克隆（后面会讲到）；
2、细胞有没有支原体感染（老问题，但是很重要，测过一大半的细胞都是不行的，很多实验室都不行，送过来检测有的细胞感染了：猪鼻支原体^(*￣(oo)￣)^，大概是这样的），还有就是一旦感染建议直接换细胞，不要想着去救，是救不过来的！
3、再有就是细胞的基因检测；可以这么说吧，细胞在培养的过程中达尔文的进化论一直在起作用，所以每一代的细胞都会累积突变，两天一代，你可以想象细胞的进化速度得多快，没错.....他们就是进化得非常快，所以很多基因都不一样了和你想的。凡是对细胞增殖有优势的基因都会被累积加起来。所以我们要对目的敲除的基因的gRNA结合位点进行测序，看看sequence对不对，要不后面切不动也不知道怎样办！ლ(′◉❥◉｀ლ)就是这样做的：设计一对PCR的primer，扩出来去测序，再对比一下基因库；太简单就不说了！
4、特别注意！！！细胞的基因拷贝数，如果是拷贝数很多（超过5），那就不要希望在这个细胞上拿到纯合敲除的细胞哈，数学原理是：
KO Rate =E^N C；
由于基因编辑效率%（E）是一个固定的常数：只和基因的位置，基因功能，gRNA的选择，选择的方法论等有关；
细胞基因拷贝数（N）：不同的细胞株，不同来源的细胞的克隆拷贝数不一样，很多细胞都不是二
倍体；
所以克隆形成率（C）：直接影响敲除效率的高低，也是基因编辑效率高低最为直接的一个系数；
【这个就是熟悉的数学啦】
5、细胞做基因敲除之前要做的事情就是：养它三代以上，让它适用你的培养基和实验室环境。
第二步，做基因敲除的转染
1、质粒脂质体的虽然低效也可以试试，好处是便宜（但是做基因点突变和KI就不用试了，效率肯定奇低无比）；
2、病毒法（慢病毒）：效率高一般是两个病毒，一个带Cas9蛋白，一个带gRNA，但是成本高，一般实验室也不想搞病毒，周期长；
3、我们用的是自己开发的VIRUS-Free技术：一个质粒搞定Cas9+gRNA+GFP+你想带的任何序列，构建稳转细胞株，和质粒一样的成本，和病毒一样高的效率，当然是结合我们独有的细胞电转技术实现的；
第三步，挑克隆或是稀释克隆法
将电转或者转染3天后的细胞进行单克隆化，筛选其中的纯合基因敲除细胞；
1、药物筛选，如果没有药物筛选就只能盲筛了，多做几个96孔板去做PCR筛选就好了；大概一般需要5-10块板吧
2、病毒法和VIRUS-Free一般就是药筛富集敲除细胞，然后就可以再接到96孔板进行单克隆，一般3-5块板；
3、ClonePlus技术，基因敲除细胞克隆筛选的利器，克隆形成率98%，一般就需要2块板；
顺带说一下：移码敲除和大片段敲除的差异！
1、移码敲除：简单点说就是导致缺少了非3倍数的碱基（3个碱基编码一个氨基酸），所以会导致后面的转运回来氨基酸都是错的，所以导致了基因功能的缺失；
优点：这个很多敲除公司使用的方法，好处是简单，便宜；
缺点：Western Blot不确定，而且细胞里面的不同基因的敲除的序列不一样，可能会有恢复修复的机制，同时mRNA也有多个转录本，不排除后面有部分的蛋白会出现。最大的缺点：细胞鉴定极其麻烦！需要PCR，测序，读图再判断，对后续细胞实验和课题实验无疑增加大量工作和不确定性。
2、大片段敲除：就是设计两个gRNA，将目的基因的一个大的片段给剪掉（100bp-10kb），导致DNA大片段的缺失，从而失去确定的DNA片段，mRNA没有转录的基础，导致基因功能敲除；这个是目前最为有效的基因敲除办法。
优点：PCR直接鉴定（扩增敲除的目的片段，条带明显变小），没有了DNA>mRNA>Protein,敲除效果有保障，WB验证更放心；
缺点：成本高，是做移码的两倍；技术相对复杂。
第四步，扩增单克隆细胞将目的单克隆扩增出来，单克隆可以大量扩增一般没有问题。记得在低代数的时候冻存起来一部分，后续的就可以扩增起来用于实验了！
整个过程做下来大概需要：6-12周，如果顺利5周也是可以拿到的。好啦，祝大家都能够拿到自己的基因敲除细胞株。
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